Calculadora de concentração de DNA e RNA por A260

Ela seleciona o fator padrão para DNA de fita dupla, DNA de fita simples ou RNA e ajusta o resultado pela diluição e pelo comprimento do caminho óptico. A saída apresenta valores equivalentes em microgramas por mililitro, nanogramas por microlitro e miligramas por mililitro, além do fator e da fórmula utilizados para que você possa conferir e registrar o cálculo.

Escolha o fator correspondente ao ácido nucleico

Uma leitura de A260 somente se torna uma concentração quando é combinada com um fator de conversão adequado. Esta calculadora usa os fatores convencionais para ácidos nucleicos relativamente puros medidos com caminho óptico de um centímetro: 50 microgramas por mililitro para DNA de fita dupla, 33 para DNA de fita simples e 40 para RNA quando A260 é igual a um. Selecione o material que realmente predomina na amostra. Não escolha DNA de fita dupla apenas porque foi usado um protocolo de extração de DNA; uma preparação composta principalmente por fitas simples curtas exige o fator de fita simples, enquanto uma preparação de RNA requer o fator de RNA. Esses fatores padrão são estimativas práticas, e não coeficientes de extinção específicos da sequência. Oligonucleotídeos com composição de bases conhecida podem ser calculados com mais precisão a partir da sequência. O fator retornado torna a premissa explícita e fornece um valor rastreável para caderno, registro de qualidade ou cálculo posterior. Em uma mistura, o resultado é uma estimativa baseada na classe predominante selecionada.

Informe corretamente a diluição e o caminho óptico

Use a absorbância depois de subtrair o branco apropriado, pois a absorção do tampão, da cubeta e do fundo não deve ser contada como ácido nucleico. O fator de diluição representa quanto a alíquota medida foi diluída em relação à amostra original. Uma amostra preparada com um volume de estoque e dezenove volumes iguais de diluente tem fator de diluição total vinte, e não dezenove. Informe um quando a amostra tiver sido medida sem diluição. A calculadora multiplica por esse fator para recuperar a concentração estimada no tubo original. Os fatores padrão de A260 pressupõem caminho de um centímetro. Se o instrumento fornecer absorbância bruta para outro caminho e ainda não normalizá-la para um centímetro, informe o comprimento real para dividir o cálculo por essa distância. Muitos espectrofotômetros de microvolume fornecem automaticamente absorbância equivalente a um centímetro, embora o caminho físico seja menor. Nesse caso, mantenha o caminho em um. Consulte a exportação ou as configurações do método para não corrigir duas vezes uma leitura já normalizada.

Interprete a concentração considerando os limites da medição

O cálculo segue concentração igual a A260 multiplicada pelo fator selecionado e pelo fator de diluição, dividida pelo comprimento do caminho. Microgramas por mililitro e nanogramas por microlitro têm o mesmo valor numérico, por isso ambas as unidades são fornecidas para facilitar o uso em protocolos laboratoriais. O resultado é determinístico e não avalia a pureza. A absorbância em 260 nanômetros pode incluir contribuições de nucleotídeos livres, fenol, proteínas, sais e outros contaminantes; assim, uma conversão matematicamente correta ainda pode superestimar o DNA ou RNA utilizável. Avalie separadamente as razões de pureza e os controles adequados e repita medições fora da faixa confiável do instrumento. Ensaios fluorescentes podem ser preferíveis quando a concentração é baixa, a contaminação é relevante ou a especificidade importa. Esta calculadora é indicada para converter de forma transparente uma medição A260 válida, realizar verificações rotineiras e automatizar processos reproduzíveis. Ela não diagnostica a qualidade da extração, não infere degradação nem certifica adequação para sequenciamento, amplificação, clonagem ou uso clínico.