Calcolatore della concentrazione di DNA e RNA da A260

Seleziona il fattore standard per DNA a doppio filamento, DNA a singolo filamento o RNA, quindi corregge il risultato per diluizione e lunghezza del cammino ottico. L’output riporta valori equivalenti in microgrammi per millilitro, nanogrammi per microlitro e milligrammi per millilitro, oltre al fattore e alla formula utilizzati, affinché Lei possa verificare e registrare il calcolo.

Scelga il fattore adatto all’acido nucleico

Una lettura A260 diventa una concentrazione solo quando viene associata a un fattore di conversione appropriato. Questo calcolatore usa i fattori convenzionali per acidi nucleici relativamente puri misurati con un cammino ottico di un centimetro: 50 microgrammi per millilitro per DNA a doppio filamento, 33 per DNA a singolo filamento e 40 per RNA quando A260 è pari a uno. Selezioni il materiale realmente predominante nel campione. Non scelga il DNA a doppio filamento soltanto perché è stato utilizzato un protocollo di estrazione del DNA: una preparazione composta soprattutto da filamenti singoli corti richiede il relativo fattore, mentre una preparazione di RNA richiede il fattore dell’RNA. Questi valori standard sono stime pratiche, non coefficienti di estinzione specifici della sequenza. Gli oligonucleotidi con composizione nota possono essere calcolati con maggiore precisione dalla sequenza. Il fattore restituito rende esplicita l’ipotesi e offre un valore tracciabile per un quaderno, un registro qualità o un calcolo successivo. Per una miscela, il risultato resta una stima basata sulla classe predominante selezionata.

Inserisca correttamente diluizione e cammino ottico

Utilizzi l’assorbanza dopo aver sottratto il bianco appropriato, perché l’assorbimento di tampone, cuvetta e fondo non deve essere conteggiato come acido nucleico. Il fattore di diluizione indica quanto è stata diluita l’aliquota misurata rispetto al campione originale. Un campione ottenuto combinando un volume di soluzione madre con diciannove volumi uguali di diluente ha un fattore totale di venti, non diciannove. Inserisca uno per un campione non diluito. Il calcolatore moltiplica per tale fattore per risalire alla concentrazione stimata nella provetta originale. I fattori A260 standard presuppongono un cammino di un centimetro. Se lo strumento riporta un’assorbanza grezza per una lunghezza diversa e non la normalizza già a un centimetro, inserisca il cammino effettivo. Molti spettrofotometri per microvolumi forniscono automaticamente un’assorbanza equivalente a un centimetro benché il cammino fisico sia più corto. In quel caso, mantenga uno. Verifichi l’esportazione o le impostazioni del metodo per evitare di correggere due volte una lettura già normalizzata.

Interpreti la concentrazione considerando i limiti

Il calcolo applica la relazione concentrazione uguale ad A260 moltiplicata per il fattore scelto e quello di diluizione, divisa per la lunghezza del cammino. Microgrammi per millilitro e nanogrammi per microlitro hanno lo stesso valore numerico, pertanto vengono restituite entrambe le unità per agevolare i protocolli di laboratorio. Il risultato è deterministico ma non valuta la purezza. L’assorbanza a 260 nanometri può comprendere nucleotidi liberi, fenolo, proteine, sali e altri contaminanti; una conversione matematicamente corretta può quindi sovrastimare il DNA o l’RNA utilizzabile. Valuti separatamente i rapporti di purezza e i controlli opportuni e ripeta le misure fuori dall’intervallo affidabile dello strumento. I saggi fluorescenti possono essere preferibili quando la concentrazione è bassa, la contaminazione è rilevante o serve specificità. Lo strumento è adatto alla conversione trasparente di una misurazione A260 valida e all’automazione riproducibile. Non diagnostica la qualità dell’estrazione, non deduce la degradazione e non certifica l’idoneità per sequenziamento, amplificazione, clonaggio o uso clinico.